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本试剂盒是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染的高温反转录系统。试剂盒采用分子进化技术高达60℃的全新高温反转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高反转录效率。

本试剂盒为一管式反转录预混Mix，5×HotScript RT MasterMix II中含有反转录第一链合所需的所有试剂（HotScript M-MuLV RTase、RNase Inhibitor、Random Primer、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。

通常Real Time RT-PCR等实验需要先用DNase I消化去除RNA中残留的基因组DNA(gDNA)，但是传统DNase I处理复杂并容易造成RNA的降解和损失。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊4×gDNA Eraser Mix 2分钟消除gDNA残留，不需要DNase消化和后续繁琐步骤。

• 新一代高温反转录酶极大提高包括复杂RNA模板的反转录效率，CT值一般提早2～3个循环。
  
• 采用gDNA Eraser仅需2分钟清除DNA残留，不需要DNase消化和后续繁琐步骤。
  
• 全预混的反转录Mix，只需加入RNA和水，15分钟简单快速完成反转录。
  
• 同时2种Mix在-20℃不易冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。
  
• 本试剂盒针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。

• 5×No RTase Control Mix除了不含HotScript M-MuLV RTase反转录酶，和5×HotScript RT MasterMix II其他成分完全一致，可以用于反转录的阴性对照。
  
• 避免RNase污染。
  
• 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
  
• 4×gDNA Eraser Mix、5×HotScript RT MasterMix II非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。4×gDNA Eraser Mix和5×HotScript RT MasterMix II内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6μL～3.8μL使用，也不影响使用效果。
  
• 可以不经过基因组去除步骤，直接用5×HotScript RT MasterMix II加RNA和水进行反转录，这样所得到的结果会与使用HotScript RT MasterMix(货号：ALH433)相当。

• 将模板RNA在冰上解冻；4×gDNA Eraser Mix和RNase-free H2O在室温（15～25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。
  
• 在RNase-free管里面加入以下成分：(建议使用PCR管冰上配制)
  

  成分	用量
  Total RNA/mRNA	≤12μL
  4×gDNA Eraser Mix	4μL(见注意事项4)
  RNase-free H2O	至16μL

• 移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟（或者37℃孵育5分钟）。控温步骤均建议PCR仪器上进行。
  
• 继续直接在同一管加入如下成分：
  

  成分	用量
  5×HotScript RT MasterMix II	4μL (见注意事项4)

• 移液器轻轻吹打混匀（总体积20μL），25℃孵育10min，50℃孵育15min。
  注意：本制品在42℃～60℃反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至55℃～60℃，有助于提高产量。
  
• 85℃加热5min失活HotScript M-MuLV RTase和gDNA Eraser。
  
• 得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。